在具有高转移倾向的非小细胞肺癌细胞中，+58CpG位点的甲基化能够降低DCN基因的表达从而增强TGF-β信号通路

【摘要】背景和目的：肺癌是全世界范围内死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌分非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）；其中NSCLC在所有肺癌中约占85％。由于在实体瘤患者中，90％的癌症死于转移，因此阐明潜在的肺癌转移机制显得尤为重要。转化生长因子β（TGF-β）是细胞生理过程中普遍存在的、重要的调节因子，如调节细胞的增殖，迁移，侵袭和免疫监视。核心蛋白聚糖（DCN）是存在于细胞外基质的、富含亮氨酸的、小分子蛋白聚糖家族的成员。它可以特异地结合TGF-β并部分阻断TGF-β的信号传导途径，从而抑制远端肿瘤，包括肺癌在内的细胞生长。然而，对于何种机制导致DCN的低表达并促进肺癌的转移尚不清楚。在我们的研究中，我们探讨了在转移的NSCLC细胞中，DNA甲基化这一表观遗传学因素是否能够导致DCN失活并影响TGF-β/Smad信号通路。方法：（1）、检测低转移的95C和高转移的95D非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力。（2）、以β-actin为内参，用q-PCR检测DCN的表达，验证DCN的表达是否会随着细胞转移能力的增强而降低。（3）、用浓度为10um的5-Aza去甲基化药物处理95C和95D细胞。5天后提取细胞DNA和RNA检测DNA甲基化和DNC基因表达的关系（。4）、选取DCN基因近端启动子（-200~+1）和5’-UTR(+1~+1,030)共1231bp片段，并用MethylPrimerExpressSoftwarev1.0和TFSEARCH软件预测含有转录因子结合的CpG位点。（5）、用95C、95D细胞和III和IV的非小细胞肺癌病人组织验证预测的功能性+58CpG位点甲基化与DCN表达之间的关系（。6）、用WesternBlot检测转录因子AHR在95C和95D细胞中是否表达。（7）、在95C和95D细胞中，用ChIP方法分析AHR能否与+58CpG位点结合。（8）、用EMSA以及构建荧光素酶报告基因来验证+58CpG位点甲基化能够降低AHR的结合能力。（9）、ELISA实验检测DCN蛋白的表达水平。（10）、用磷酸化的SMAD3与SMAD3之间的比值以及EMT标记分子E-cadherin来衡量TGF-β通路的活性水平。结果：（1）DNA甲基化参与了DCNmRNA的表达。（2）经软件预测，+58CpG位点是一个潜在的功能性CpG位点。(3)在转移的NSCLC细胞中，95D细胞的+58CpG位点甲基化频率明显高于95C细胞，而且与DCN的表达具有相关性。（4）AHR能够与DCN基因5′-UTR区的+58CpG位点结合。（5）+58CpG位点的甲基化能够影响转录因子与DCN基因5′-UTR区的结合能力。（6）+58CpG位点的甲基化能够抑制荧光素酶报告基因的活性。（7）在转移的NSCLC细胞中，DCN抑制了磷酸化的SMAD3并增强了E-cadherin的表达。结论：在这项研究中，我们发现了在高转移性非小细胞肺癌细胞中，DCN基因5’-UTR区甲基化的+58CpG与DCNmRNA表达降低有关。我们的研究结果显示，+58CpG甲基化可能是导致AHR低招募到DCN5’-UTR区的机制之一，从而促进TGF-β/Smad信号增强磷酸化Smad3蛋白表达，最终下调E-cadherin的表达。
【作者】石祥广；
【导师】张洪涛；
【作者基本信息】苏州大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】非小细胞肺癌；DCN；+58CpG甲基化；TGF-β/Smad信号；

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